激素性股骨頭壞死（SONFH）是一種臨床上常見的進(jìn)行性骨病，近年來發(fā)病率不斷上升，占股骨頭壞死總病例的25-51%。若不及時(shí)治療，會(huì)導(dǎo)致股骨頭結(jié)構(gòu)改變及塌陷，引起髖關(guān)節(jié)疼痛及功能障礙。

研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）可以促進(jìn)骨修復(fù)，有望治療早期激素性股骨頭壞死。然而，SONFH有一個(gè)獨(dú)特的病理因素，即患者股骨頭壞死區(qū)的氧濃度通常低于1%，形成了局部缺氧微環(huán)境，可導(dǎo)致BMSC發(fā)生缺氧性凋亡，并限制了其成骨修復(fù)能力。因此，目前急需開發(fā)新方法來抑制缺氧引起的BMSC凋亡和提高BMSC移植的療效。

貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA Tmem235在這種缺氧環(huán)境中下調(diào)。他們通過一系列實(shí)驗(yàn)表明，Lnc Tmem235可抑制BMSC的缺氧性凋亡，從而改善BMSC治療早期激素性股骨頭壞死的效果。這項(xiàng)研究成果已發(fā)表在《Experimental & Molecular Medicine》雜志上。

文獻(xiàn)封面截圖^[1]

研究材料與方法

在這項(xiàng)研究中，研究人員從雄性SD大鼠中提取出BMSC，并利用賽業(yè)OriCell^?提供的大鼠BMSC成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化試劑盒驗(yàn)證了BMSC的誘導(dǎo)分化性能。然后，通過lncRNA芯片分析篩選出與BMSC缺氧性凋亡相關(guān)的lncRNA，并通過基因過表達(dá)和沉默分析來探究Lnc Tmem235抑制BMSC凋亡的具體機(jī)制。最后，利用雄性SD大鼠構(gòu)建了早期激素性股骨頭壞死模型，并在移植BMSC后利用micro-CT系統(tǒng)監(jiān)測(cè)了骨結(jié)構(gòu)和骨密度。

技術(shù)路線

探討缺氧環(huán)境對(duì)BMSC的影響，通過lncRNA芯片和過表達(dá)等分析確定，Lnc Tmem235抑制了BMSC的缺氧性凋亡

通過過表達(dá)和干擾分析確定Lnc Tmem235通過調(diào)節(jié)BIRC5的表達(dá)，來抑制BMSC的缺氧性凋亡

深入分析機(jī)制后發(fā)現(xiàn)Lnc Tmem235與BIRC5 mRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-34a-3p，從而促進(jìn)BIRC5的表達(dá)

在早期激素性股骨頭壞死模型中，Lnc Tmem235通過抑制BMSC的缺氧性凋亡，改善了BMSC移植的治療效果

研究結(jié)果

01

Lnc Tmem235抑制BMSC的缺氧性凋亡

研究人員從骨髓中成功分離出BMSC，并探討了不同缺氧環(huán)境對(duì)BMSC的影響。由于股骨頭壞死區(qū)的氧氣濃度低于1%，故他們用0%的氧氣濃度來建立BMSC的體外缺氧模型。結(jié)果顯示，BMSC暴露于缺氧環(huán)境后，線粒體膜電位和ATP水平下降，而ROS水平上升。同時(shí)，大量的BMSC發(fā)生凋亡。

考慮到lncRNA在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，接下來有哪些lncRNA與缺氧誘導(dǎo)的BMSC凋亡有關(guān)呢？lncRNA芯片分析顯示，在缺氧條件下有99個(gè)lncRNA上調(diào)，183個(gè)lncRNA下調(diào)。進(jìn)一步分析表明，Lnc Tmem235在BMSC缺氧模型中的表達(dá)明顯下調(diào)，且其表達(dá)隨缺氧程度的加重和凋亡比例的增加而持續(xù)下調(diào)。這些結(jié)果表明，Lnc Tmem235可能與BMSC的缺氧性凋亡有關(guān)。

Lnc Tmem235基因座位于10號(hào)染色體上，處于BIRC5基因的下游。研究人員發(fā)現(xiàn)，Lnc Tmem235不具備編碼蛋白質(zhì)的能力，主要分布在BMSC的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。在缺氧條件下，Lnc Tmem235和Bcl-2的表達(dá)水平下調(diào)，Bax和CASP-3的表達(dá)水平上調(diào)，BMSC凋亡比例超過70%。然而，Lnc Tmem235的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了這些結(jié)果，促進(jìn)了BMSC在缺氧條件下的存活（圖1）。這表明，Lnc Tmem235抑制了BMSC的缺氧性凋亡。

圖1. Lnc Tmem235抑制了BMSC的缺氧性凋亡^[1]

02

Lnc Tmem235通過調(diào)節(jié)miR-34a-3p/BIRC5軸抑制BMSC的凋亡

那么，Lnc Tmem235是通過何種機(jī)制抑制BMSC的缺氧性凋亡呢？研究人員在BMSC中過表達(dá)Lnc Tmem235后，通過芯片分析來檢測(cè)細(xì)胞的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)BIRC5的表達(dá)明顯上調(diào)。之后的qPCR分析證實(shí)了芯片分析的結(jié)果。作為凋亡抑制劑，BIRC5可直接抑制CASP-3和CASP-9的活性，阻斷細(xì)胞凋亡。因此，他們推測(cè)Lnc Tmem235通過調(diào)節(jié)BIRC5的表達(dá)來抑制BMSC凋亡。

在上調(diào)Lnc Tmem235的表達(dá)后，他們用慢病毒干擾載體下調(diào)了BIRC5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BIRC5的下調(diào)明顯削弱了Lnc Tmem235的抗凋亡作用。相反，在Lnc Tmem235表達(dá)被下調(diào)后，BIRC5的過表達(dá)有效減輕了缺氧誘導(dǎo)的BMSC凋亡。這些結(jié)果證實(shí)，Lnc Tmem235通過調(diào)節(jié)BIRC5的表達(dá)來抑制BMSC的缺氧性凋亡。

研究人員推測(cè)，也許有某個(gè)miRNA與BIRC5 mRNA結(jié)合，而Lnc Tmem235通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA來釋放miRNA對(duì)目標(biāo)基因的沉默，最終促進(jìn)BIRC5的表達(dá)。他們通過生物信息學(xué)工具將目標(biāo)鎖定為miR-34a-3p。

通過RIP分析，他們發(fā)現(xiàn)miR-34a-3p的過表達(dá)明顯增加了Lnc Tmem235和BIRC5 mRNA在miRNA核糖核蛋白復(fù)合物（miRNP）中的富集。熒光素酶活性分析也顯示，miR-34a-3p可以與Lnc Tmem235或BIRC5 mRNA上的預(yù)測(cè)位點(diǎn)結(jié)合。后續(xù)分析表明，Lnc Tmem235可作為ceRNA，與BIRC5 mRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-34a-3p，從而解除miR-34a-3p對(duì)BIRC5 mRNA的沉默，最終促進(jìn)BIRC5的表達(dá)。

當(dāng)BMSC處于缺氧狀態(tài)時(shí)，Lnc Tmem235的過表達(dá)導(dǎo)致BIRC5表達(dá)被上調(diào)，細(xì)胞凋亡明顯減少。在此基礎(chǔ)上上調(diào)miR-34a-3p的表達(dá)，則BIRC5表達(dá)下降，細(xì)胞凋亡增加。這表明miR-34a-3p阻斷了Lnc Tmem235的抗凋亡作用。之后，研究人員又上調(diào)了BIRC5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡減少（圖2）。這些結(jié)果表明，Lnc Tmem235通過調(diào)節(jié)miR-34a-3p/BIRC5軸抑制了BMSC的缺氧性凋亡。

圖2.  Lnc Tmem235通過調(diào)節(jié)miR-34a-3p/BIRC5抑制了BMSC的缺氧性凋亡^[1]

03

Lnc Tmem235促進(jìn)早期激素性股骨頭壞死的修復(fù)

此外，研究人員利用脂多糖和甲潑尼龍建立了早期激素性股骨頭壞死模型。他們發(fā)現(xiàn)，在骨壞死區(qū)的缺氧微環(huán)境中，大量的移植BMSC出現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)的凋亡，嚴(yán)重限制了BMSC移植的效果。既然Lnc Tmem235能夠抑制BMSC的缺氧性凋亡，那么它是否能改善BMSC對(duì)早期SONFH的治療效果？

他們?cè)谶^表達(dá)或沉默Lnc Tmem235后，用DiR標(biāo)記BMSC，并與異種脫抗原松質(zhì)骨（XACB）共同培養(yǎng)來構(gòu)建組織工程骨，以修復(fù)早期SONFH模型。與對(duì)照組相比，Lnc Tmem235過表達(dá)組的DiR熒光強(qiáng)度和BIRC5表達(dá)水平更高，TUNEL陽性細(xì)胞的比例明顯下降，而在Lnc Tmem235低表達(dá)組中，TUNEL陽性細(xì)胞比例增加。這表明Lnc Tmem235抑制了缺氧微環(huán)境中BMSC的凋亡，促進(jìn)了BMSC的存活。

在手術(shù)后12周，他們通過多個(gè)指標(biāo)評(píng)估了BMSC的修復(fù)效果。與對(duì)照組相比，Lnc Tmem235過表達(dá)組的缺損區(qū)完全修復(fù)，且骨組織趨于成熟。骨小梁數(shù)目、骨小梁厚度、骨體積、骨體積分?jǐn)?shù)以及多個(gè)成骨標(biāo)志物的水平都明顯增加。相反，Lnc Tmem235低表達(dá)組的各項(xiàng)指標(biāo)都明顯低于對(duì)照組。這些結(jié)果表明，Lnc Tmem235通過抑制BMSC的缺氧性凋亡，改善了BMSC對(duì)早期SONFH的治療效果。

結(jié)論

圖3. Lnc Tmem235在通過移植BMSC修復(fù)早期SONFH中的作用和機(jī)制^[1]

總的來說，這項(xiàng)研究表明Lnc Tmem235通過調(diào)節(jié)miR-34a-3p/BIRC5來抑制BMSC的缺氧性凋亡，而這種抑制改善了BMSC對(duì)早期激素性股骨頭壞死的治療效果（圖3）。這項(xiàng)研究為減少BMSC的缺氧性凋亡和改善BMSC移植的療效提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)和方法。