目前已上市的納米抗體藥物共有三種，包括Ablynx的納米單抗卡拉西單抗(Caplacizumab)和雙特異性抗體Ozoralizumab以及康寧杰瑞的恩沃利單抗(Envafolimab)。此外，還有多個納米抗體進入到臨床研究階段，廣泛分布在包括腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病等各種領(lǐng)域。

納米抗體的人源化改造

納米抗體

納米抗體由于其穿透性好、結(jié)合活性強、穩(wěn)定性高等特點，使其不僅作為單抗藥物性質(zhì)優(yōu)越，并且便于開發(fā)雙特異性抗體藥物、抗體藥物偶聯(lián)物(Antibody-drug conjugate, ADC)以及嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor, CAR)細胞藥物等，因此廣受藥物研究者青睞[1]。

駝科動物外周血中會產(chǎn)生兩種不同類型的IgG抗體，如下圖1所示，一類是由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的常規(guī)IgG1抗體(MW~150 kDa)，另一類則是包括IgG2和IgG3(MW~90 kDa)在內(nèi)的缺少輕鏈及重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的重鏈抗體(HCAb)。重鏈抗體的可變區(qū)稱為單域抗體(sdAb)，也稱為納米抗體或VHH。VHH被認為是最小的抗原結(jié)合單位。

圖1 駝科動物外周血中的抗體

人源化改造

為了降低潛在的免疫反應(yīng)，提高安全性，用于人體的抗體藥物常常需要進行人源化改造。由于VHH抗體體積小、具有免疫原性的表位少且血清半衰期較短等，人們普遍認為其免疫原性顯著低于傳統(tǒng)雙鏈抗體[2]。但是VHH中較長的的CDR1和CDR3區(qū)以及非經(jīng)典的二硫鍵是人類基因庫中不存在的構(gòu)象(如圖2所示)，可能存在由構(gòu)象表位引發(fā)的免疫原性的潛在風(fēng)險。

Noncanonical disulfide linkage

圖2 VH與VHH的結(jié)構(gòu)示意圖[3]

此外，VHH的CDR和FR區(qū)高水平的體細胞超突變也限制了VHH與人類免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因(Immunoglobulin heavy-chain variable gene, IGHV)序列的同源性[4]。因此，在開發(fā)VHH藥物時出于藥效及安全性考慮會對駝科VHH進行人源化改造。目前已上市的三款VHH抗體藥，均進行了人源化改造。

人源化納米抗體純化的挑戰(zhàn)

為了避免引入更多風(fēng)險因素，大多情況下制藥企業(yè)不會在納米抗體上添加Flag、His等標(biāo)簽蛋白，且納米抗體的人源化改造可能會導(dǎo)致原本針對駝科納米抗體的純化方法不適用，這為人源化納米抗體的純化帶來了很多障礙。

有些企業(yè)會設(shè)計Fc融合的納米抗體，在延長納米抗體半衰期的同時可以使用Protein A等方式對融合的納米抗體進行純化。但是融合Fc的納米抗體也會失去它分子量小的優(yōu)勢，同時可能會引發(fā)非特異性結(jié)合(許多細胞具有Fc受體)以及Fc介導(dǎo)的補體反應(yīng)。

所以有些特定的情況下，還是需要設(shè)計Tag-free的納米抗體藥物，但是目前尚無有效的親和純化Tag-free的人源化納米抗體的方法。    

應(yīng)對策略推薦

GenScript開發(fā)了Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF(GenScript，L00951)，可助力人源化納米抗體的純化及藥物的開發(fā)。

結(jié)構(gòu)及原理

Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF通過共價偶聯(lián)的方式將Anti-Humanized VHH Antibody偶聯(lián)到高度交聯(lián)的瓊脂糖微球上，細胞裂解物中的人源化VHH單域抗體可以與偶聯(lián)到填料上的Anti-Humanized VHH Antibody特異性結(jié)合，從而達到純化人源化VHH的目的(如圖3所示)。

圖3 Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF

結(jié)構(gòu)和純化原理示意圖

應(yīng)用場景

Anti- Humanized VHH Affinity Resin FF的填料是在瓊脂糖凝膠4B的基礎(chǔ)上經(jīng)過化學(xué)交聯(lián)形成的高度交聯(lián)的介質(zhì)，因此化學(xué)穩(wěn)定性和物理剛性顯著增強。除了可通過柱層析、批量結(jié)合或免疫沉淀(IP)等方式，還能通過各種常規(guī)的中低壓色譜系統(tǒng)(如AKTA純化系統(tǒng))純化目標(biāo)蛋白。

該產(chǎn)品的親和配基Anti-Humanized VHH Antibody對人源化VHH較高的親和力和特異性使其能夠從常用的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)(如細菌、酵母和哺乳動物細胞)中獲得較高純度的人源化VHH(如圖4所示)。

圖4 柱層析方式純化人源化VHH示意圖

產(chǎn)品特性

金斯瑞MonoRab? Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF的主要特性如下表：

表1 Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF的特性

案例展示

1．Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF從E. coli裂解液中純化人源化VHH#1蛋白。

2．Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF從E.coli裂解液中純化人源化VHH#2蛋白。

3．Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF重復(fù)使用次數(shù)

結(jié)果表明，該產(chǎn)品重復(fù)使用10次后，載量沒有明顯下降。

產(chǎn)品推薦

不同規(guī)格介質(zhì)

抗體及抗體標(biāo)記物

文章轉(zhuǎn)載自金斯瑞目錄產(chǎn)品微信公眾號